盘点影响三箱社交实验的因素

　　社会交往介绍
　　其简称社交，是指群居动物个体之间的交际往来，通过传递信息、交流思想达到某种目的的各项社会活动总称。对于啮齿类动物而言，它们借助不同的感觉如视、听、触等来感知和传递信息，实现社交。以喜好群居的小鼠为例，其常见的社交行为表现为相互嗅探、肢体接触、追逐、超声发声等。
　　当处于某些疾病状态时，如孤独症、社交恐惧症、社交挫败症等，小鼠的社交状态会发生一定改变。因此，为了量化小鼠的社交状态，以往研究采用了多种测试社交状态的行为范式，如三箱社交实验（threechambersocialpreferencetest，TCSP）、居住者入侵实验（residentintrudertest）、社交奖赏实验（socialrewardtest）和超声发声记录（ultrasonicvocalizationsrecording）等。
　　其中，TCSP是经典的测试社交状态的方法，是基于小鼠天生喜好群居、对外界环境敏感以及对新物体具有探索欲望等特性而设计的。该方法将小鼠间嗅探、追逐等难以量化的社交行为转化为对小鼠在特定区域（有社交对象）的活动时间和距离的评估，实验过程简单、易操作，能够快速量化小鼠社交状态，因此被广泛用于评估正常小鼠的社交行为及疾病模型中社交行为改变情况。但是，行为实验容易受多种因素的影响，有文献报道性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节因素都会显著影响某些行为实验结果，鲜有研究探讨以上这些因素对TCSP的影响。因此，本研究分析上述因素是否对正常小鼠TCSP结果造成影响，为明确和标准化TCSP流程、准确评估小鼠社交状态提供依据。材料和方法
　　实验动物追溯297只614周龄饲养在（specificpathogenfree，SPF）屏障内或独立通风笼盒（inpidualventilatedcages，IVC）系统内的雌雄C57BL6小鼠的原始实验数据，小鼠体重2030g。在整个实验期间，小鼠在恒温（241），12h光照12h黑暗循环的动物房中饲养，每笼4只，自由获取食物和水。1实验装置及流程
　　TCSP装置（自制）包括一个62cm42cm24cm三箱箱体和两个直径8cm的圆柱形罩笼（Fig。1A）、录像系统、动物行为分析软件。
　　三箱社交行为实验，XRXJ117，上海欣软
　　测试当天，提前30min将实验小鼠和工具小鼠（与实验小鼠同性别，同品系，之前从未接触过）移至行为室适应环境。TCSP分为适应阶段和测试阶段。在适应阶段，关闭两侧箱体隔板，将实验小鼠放入装置中间箱体中自由探索5min。测试阶段时，先将工具小鼠放入两侧箱体任意一侧罩笼中，同时打开两侧箱体隔板，实验小鼠在三个箱体自由探索，从顶部视频俯拍实验小鼠在装置内10min的活动。
　　结束后，使用动物行为分析分析实验小鼠在三个箱体中探索时间占比。将有工具小鼠罩笼一侧定义为社交区、中间箱体定义为中间区、摆放空罩笼一侧定义为空白区，计算Preferencescore（社交区探索总时长空白区探索总时长）（社交区探索总时长空白区探索总时长）。采用Preferencescore评价小鼠的社交偏好。Preferencescore越接近1，说明小鼠更倾向于与工具小鼠社交，社交状况良好；当Preferencescore越接近1，即与工具小鼠社交互动少，说明小鼠具有社交障碍。每只实验小鼠测试完成后使用75酒精清洁装置和去除气味，待酒精挥发完毕后再测试下一只动物。2性别因素
　　为探讨性别因素是否会对三箱社交行为产生影响，故本实验选取的实验小鼠雌雄各半，且分为两组：雄性组（male）和雌性组（female）。3年龄因素
　　本实验选取的实验小鼠为614周龄，为探讨年龄因素是否会对三箱社交行为产生影响，故将小鼠分为两组：大于10周龄组（older）和小于10周龄组（younger）。4实验装置因素
　　以往的三箱实验装置多为箱体底板一体式，该种设计稳定性和密闭性较好，但清洁箱体死角时较为不便。为此，我们设计了一种新型分离式的实验装置（实用新型专利，授权号：CN215898595U），可以将箱体和底板完全分开，便于彻底清理箱体死角。为探讨这两种不同的实验装置是否会对TCSP产生影响，故将小鼠分为两组：一体式（integrated）和分离式（split）。5行为实验室因素
　　为探讨行为实验室因素是否会对TCSP产生影响，本实验随机分在两个不同的行为实验室中进行：行为室1（room1）无恒温系统，易受外界环境的干扰；行为室2（room2）具备恒温系统（241）且隔音效果良好（噪音35dB）。6动物饲养室因素
　　本实验中选取的实验小鼠分别饲养在两种级别不同的动物饲养室：无特定病原体级（SPF）标准动物饲养室和独立通风笼盒（IVC）清洁级动物饲养室。为探讨动物饲养室因素是否会对TCSP产生影响，故将小鼠分为两组：SPF组和IVC组。7季节因素
　　本实验进行的时间跨度较长，季节变化可能会影响动物自身的节律从而影响社交行为，因此为探讨季节因素是否会对TCSP产生影响，故将小鼠分为4组：春季（spr。）、夏季（sum。）、秋季（fal。）和冬季（win。）。8统计学处理
　　实验数据以均数标准差（xs）表示。两组之间经正态性和方差齐性检验后使用twotailedunpairedttest；多组之间经正态性和方差齐性检验后使用onewayANOVA，事后检验采用Tukey’s多重比较；多因素回归分析采用多元线性回归并选择强行进入法筛选自变量。当P0。05，为差异具有统计学意义。结果1。各因素TCSP结果比较
　　通过动物行为分析软件分析出小鼠在各个箱体时间占比后，再计算得出偏好得分（Preferencescore）。结果显示：male组与female组（t1。4780，df104，P0。1423）、older组与younger组（t0。0084，df95，P0。9933）、integrated组与split组（t0。1460，df90，P0。8842）、room1组与room2组（t0。1006，df91，P0。9201）、SPF组与IVC组（t0。9588，df104，P0。3399）、spr。组与sum。组、fal。组、win。组（P0。1502）均无显著性差异，说明性别（Fig。1B）、年龄（Fig。1C）、实验装置（Fig。1D）、行为实验室（Fig。1E）、动物饲养室（Fig。1F）、季节（Fig。1G）均未能显著影响小鼠TCSP结果，小鼠仍具有正常的社交偏好。
　　2。多因素对TCSP结果的影响
　　由于性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节可能并非单独地影响动物的社交表现，因此需要使用多元线性回归来探讨多种因素对TCSP测试结果的综合影响。首先，根据观测各因素汇总的散点图（Fig。2）发现，各因素之间并未显示出明显的线性关系。然后通过使用SPSS21。0，对性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节这些自变量进行赋值（表1），选择强行进入法对回归模型中的自变量进行筛选，最后进行模型拟合并输出结果和绘制图形。通过标准化残差标准PP图（Fig。3）和标准化预计值残差图（Fig。4）发现TCSP数据所建立的回归模型随机误差项具有良好正态性和方差齐性，但回归模型系数结果表明性别（P0。883）、年龄（P0。095）、实验装置（P0。497）、行为实验室（P0。074）、动物饲养室（P0。748）和季节（P0。148）均未出现显著性故不能纳入回归模型中。综上，多因素回归分析发现以上这些因素均不能显著影响动物的社交表现（表2）。
　　讨论
　　社会交往是群居动物间交流传递信息的一种必要方式，啮齿类动物通过嗅探、肢体接触、追逐、超声等进行社交，促进个体生存和群体繁衍等。据报道，在孤独症、社交恐惧症、社交挫败症等疾病模型中，动物的社交偏好会明显下降。在直接测量小鼠诸如嗅探、身体接触等行为时，现有人工分析方法不宜定量。TCSP是一种简单易操作且能定量获取动物社交状态的实验方法。近年来文献提示行为实验易受动物自身状态、实验环境和实验人员的干扰。作为行为实验的一种，TCSP可能也会受性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节等因素的影响，导致社交状态评估结果不稳定。以上这些因素对TCSP的影响尚未见报道。本研究分别评估了性别、年龄阶段、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节等因素对TCSP的影响，单因素分析结果发现各因素均未影响小鼠的社交状态，说明TCSP具有良好的稳定性和可重复性。
　　社交行为测试时小鼠常同时受多种因素影响，因此单因素分析往往不能更准确地评价各因素的干扰和交互作用。基于此，本研究使用多元线性回归探讨了多因素对TCSP结果的综合效应，结果显示综合性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节因素的同样均不影响小鼠的社交状态。同时本次大样本量行为实验数据（297只小鼠）分布具备了良好正态性和方差齐性，说明了正常小鼠即使在多种因素影响下其社交状态依然具有较好的稳定性。之前文献报道，开放旷场行为实验易受动物状态的影响，Morris水迷宫实验易受季节的影响，恐惧记忆行为实验易受不同实验装置的影响等，而马乖乖：小鼠三箱社交偏好测试影响因素追溯分析673我们的结果表明，TCSP不会受多种因素的影响，这可能主要因为社交对群居动物的重要性远胜过上述干扰因素的影响。研究表明，社交行为会激活脑内奖赏系统，这可能是小鼠克服种种因素干扰进行社交活动的重要内驱力之一。综上所述，我们发现性别、年龄、实验装置、行为实验室、动物饲养室和季节因素均未显著地影响TCSP。维持小鼠TCSP稳定这一行为现象背后的分子机制尚不清楚，有待进一步深入研究。
　　原文信息：文章来源于马乖乖，黄琦逸等老师发表的《小鼠三箱社交偏好测试影响因素追溯分析》，原文DOI：10。16557j。cnki。10007547。2022。06。010