近日，莱斯大学的一个合成生物学家团队声称，他们已经开发出第一个可以观察细菌中某些信号处理电路的实时活动的方法，包括使用这些电路来增加其毒力以及产生抗生素耐药性的致命病原体，用于观察双组分系统中实时磷酸化反应的新光学工具。该研究以“ ”为题发表在 PNAS 上。
（来源： PNAS ）
莱斯生物工程教授 博士解释说，双组分系统是细菌用来对周围环境做出反应并生存的感觉回路。细菌使用这些电路（也称为信号转导途径）来感知从光和金属离子到 pH 值等信息的刺激范围。
细菌利用双组分系统 (TCS) 信号转导途径来感知和适应不断变化的环境。在典型的 TCS 中，刺激诱导传感器组氨酸激酶 (SHK) 磷酸化反应调节剂 (RR)，然后二聚化并激活转录反应。在这里，研究人员证明了融合的 mNeonGreen 荧光蛋白探针对激发光的寡聚依赖性去极化能够实时监测活细菌中的 RR 二聚化动力学，使用诱导型启动子独立表达 SHKs 和 RRs，在几种模型途径中在刺激添加的几秒钟内检测到 RR 二聚化。
研究人员通过将实验与数学模型相结合，以揭示 TCS 磷酸信号传导随着 SHK 表达而加速，但随着 RR 表达和 SHK 磷酸酶活性而减速。当相应的 TCS 从可诱导系统和天然染色体操纵子中表达时，进一步观察到 SHK NarX 响应于细胞外电子受体硝酸盐的添加和消耗的脉动激活。最后，研究人员将他们的方法与偏振光显微镜相结合，以在不断变化的刺激条件下实现 RR 二聚化的单细胞测量。RR 寡聚化动力学的直接体内表征应该能够深入了解细菌生理学的调节。
“细菌使用双组分系统来激活毒力和抗生素抗性，在人类和植物宿主中定植，形成生物膜和污染医疗设备，” 说道。2019 年，他的团队发现了一个生物黑客工具包，可以使用它来混合和匹配来自电路的数以万计的感官输入和遗传输出。
这些电路有两个功能：感知细胞外的刺激和改变细胞响应该刺激的行为。第一个成分是一种传感器激酶，通常会从细胞外壁突出，并且只能被特定的化学信号激活。一旦被触发，它就会在细胞内引发生化连锁反应，促使细胞改变其行为以响应刺激。级联反应的第一步是磷酸化，这会激活系统的第二个组成部分，即反应调节剂。
“磷酸化的实验分析通常需要从细菌中纯化蛋白质，并使用凝胶电泳等费力的体外方法进行分析，”博士后研究员 指出。Butcher 开发了一种更简单的方法，该方法依赖于荧光蛋白标签和偏振荧光。他设计了大肠杆菌菌株来生产 mNeonGreen 荧光蛋白探针，这些探针可以使来自激发激光的光去偏振，但前提是它们成对相互作用。
在许多测试中， 和 表明他们的方法可用于监测各种环境条件下响应调节器激活的幅度和速度。该方法称为同型荧光共振能量转移或“homo-FRET”。Tabor 说，研究人员可以使用它来跟踪双组分系统的激活，其时间分辨率比以前更高。在这项研究中，Tabor 和 通过观察已知在大肠杆菌、沙门氏菌和其他病原体的胃肠道定植中起作用的硝酸盐激活的双组分系统证明了同型 FRET 的效用。
▲ 图丨用于检测 RR 二聚化的 mNG homo-FRET 方法（来源： PNAS ）
和 在电路中发现了以前未报告的响应添加硝酸盐的活动脉冲。脉冲似乎是由于双组分系统的快速激活，随后细菌消耗硝酸盐和相应的失活而出现的。
“这是了解该电路如何工作的一个窗口，使用以前的方法很难确定这种情况，” 解释说。“使用 homo-FRET，我们可以观察电路对硝酸盐水平变化的反应。我们认为，homo-FRET 可用于设计响应速度比当前替代品快 10 倍的生物传感器，并且将能够使用它在一系列其他细菌途径中做出新发现。”
参考资料：
1. https://worldbiomarketinsights.com/synthetic-biologists-develop-tool-to-observe-bacterial-signal-processing-in-real-time/
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