研究发现过量食用黄芪引发上火的机制

　　上火是中医学的一种俗称，其基本病机为阴阳失调，阳胜则热。中医学认为上火是在机体受到邪气侵袭后，引起机体出现一系列以热证为表现的症状。咽喉肿痛、目赤干涩、牙龈发炎、口腔溃疡、小便短赤、大便秘结等为上火的典型症状〔1〕。
　　黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch。）Bge。var。mongholicus（Bge。）Hsiao或膜荚黄芪A。membranaceus（Fisch。）Bge。的干燥根，其味甘，性温，归肺、脾经。黄芪作为一种大宗药材和人们经常以各种方式食用的保健品，具有广泛的应用前景和药理活性〔23〕，但长期过量食用黄芪产生的不良反应少被讨论。由于黄芪性温热，过量进补黄芪可能会导致上火症状，且黄芪常用来构建上火或实热动物模型〔4〕。由于上火缺乏客观量化的诊断指标，因此应用现代技术揭示上火的生物学标志及导致上火的物质基础具有重要意义〔5〕。本研究在中医对上火认识的基础上，运用现代生物学技术，开展对过量食用黄芪引发上火的机制研究，拟为黄芪保健品的开发提供参考依据。
　　中药中化学成分复杂，同类的不同成分之间在体内也可能存在相互转化的现象，因此通过成分敲除的方法来进行功效的验证难以达到理想的效果。基于此，本研究以黄芪为例，进行了某个部位即某类成分的扣除，目的是排除成分敲除时结构相近的成分在体内转化造成的影响，通过部位扣除并结合单个部位给药进行黄芪温热效应引起上火的物质基础验证。黄芪主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类等成分〔6〕。本研究首先对黄芪水煎液进行了部位分离，运用醇沉法分离多糖。由于黄酮类成分含量相对较低，且黄酮部位和皂苷部位极性非常相近，加大了分离的难度〔7〕。
　　本研究根据文献报道的树脂分离技术〔89〕，比较了2种方法对黄芪水煎液中黄酮类和皂苷类成分的富集和分离程度，建立了1种快速有效的部位分离方法，并且采用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLCQOrbitrapHRMS）对所分离的2个部位中化学成分进行鉴别。最后将分离所得各个部位ig给药，从大鼠的一般状态、炎症、甲状腺和肾上腺功能、能量代谢和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase，AMPK）通路等方面进行指标检测。
　　1、提取物的主要成分是什么？
　　经计算得总多糖质量浓度为7。3710gmL，质量分数为51；总皂苷质量浓度为4。0836gmL，质量分数为83；总黄酮质量浓度为3。9852gmL，质量分数为81。
　　黄酮类成分鉴别
　　通过XCalibur软件对黄酮部位进行分析鉴别，结果见表1（F1F21）。通过与对照品tR及二级碎片对比，成分F4F6分别被鉴定为芒柄花苷、芒柄花素和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。
　　皂苷类成分鉴别
　　通过XCalibur软件对皂苷部位进行分析鉴别，结果见表1（S1S6）。通过与对照品tR及二级碎片比较，成分S3被鉴定为黄芪甲苷。根据文献报道〔1720〕，S1S6分别被鉴定为黄芪甲苷I、黄芪甲苷II、黄芪甲苷、黄芪甲苷、大豆皂苷I和环黄芪醇。
　　2黄芪各给药组对大鼠一般状态的影响
　　对大鼠体质量的影响
　　如表2所示，在给药过程中，各组大鼠体质量均逐渐升高，而与对照组相比，各组大鼠体质量无显著性差异。说明各给药组对大鼠体质量的增长影响较小。
　　对大鼠肛温的影响
　　如表3所示，与对照组相比，给药第14、28天各给药组大鼠肛温均有所升高，其中全成分组大鼠肛温升高有显著性差异（P0。05、0。01），可以体现黄芪的温热效应，全成分组温热效应最强。分别扣除各个部位后，只有缺多糖组在第14天肛温升高有显著差异（P0。05），而这种显著性在第28天测定时又消失，其余均无显著性差异，说明对于体温的升高，不是某个部位的单独作用，而是黄芪3个部位以及其余成分的综合作用，符合中医理论的整体观念。
　　给药第14天，与对照组相比，缺皂苷组与缺黄酮组大鼠唾液量显著升高（P0。01、0。001）；给药第21天，与对照组相比，全成分组、缺多糖组与缺黄酮大鼠唾液量显著降低（P0。001），黄酮组与缺皂苷组大鼠唾液量显著升高（P0。05）。给药第28天，与对照组相比，多糖组、皂苷组与缺黄酮组大鼠唾液量显著降低（P0。001）。全成分组在第21、28天唾液量均减少，可能为上火症状的体现。多糖组、皂苷组在第28天唾液量显著降低，而缺多糖组、缺皂苷组唾液量并没有降低，黄酮组唾液量没有显著降低，而缺黄酮组即多糖和皂苷配伍组唾液量显著降低，说明长时间大剂量服用黄芪导致唾液量减少的上火症状来源于黄芪组分中的多糖部位和皂苷部位。
　　对大鼠摄食量、粪便量及粪便含水量的影响
　　如表4所示，给药第14天，与对照组相比，多糖组大鼠摄食量显著减少（P0。05），黄酮组大鼠摄食量显著升高（P0。001）；给药第21天，与对照组相比，缺皂苷组和缺黄酮组大鼠摄食量显著降低（P0。01、0。001）；给药第28天，与对照组相比，缺黄酮组大鼠摄食量显著减少（P0。001）。
　　与对照组相比，除全成分组大鼠粪便量有所减少外，其余组别大鼠粪便量均升高，其中黄酮组具有统计学意义（P0。01）。对于粪便含水量而言，与对照组相比，全成分组与多糖组大鼠粪便含水量显著降低（P0。05、0。01），缺皂苷组大鼠粪便含水量显著升高（P0。001）。
　　联合摄食量和粪便量可知，黄酮组粪便量显著增加的原因可能为摄食量的增加，而全成分组以及多糖组粪便含水量显著降低则可能为上火症状的体现。结合全成分组、多糖组以及缺多糖组的粪便含水量，说明对于粪便量干燥的上火症状可能主要源于多糖类组分。
　　3黄芪各给药组对大鼠血清炎症因子的影响
　　如图5所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组大鼠血清中TNF水平显著升高（P0。05、0。001），缺皂苷组大鼠血清中TNF水平没有升高，而缺多糖组依然显著性升高（P0。01），说明黄芪全成分升高TNF的作用可能来自于皂苷部位、多糖部位，且皂苷部位的影响可能较大。此外，与对照组相比，全成分组血清中IL1水平显著升高（P0。05），多糖组IL6表达水平显著升高（P0。01）。表明过量食用黄芪时，其多糖和皂苷可能通过升高促炎因子水平诱发炎症反应，导致上火症状。
　　4黄芪各给药组对大鼠血清甲状腺功能的影响
　　如图6所示，与对照组相比，多糖组、皂苷组和黄酮组大鼠血清中T3水平显著降低（P0。05），缺黄酮组大鼠T4水平显著升高（P0。05），各组大鼠TRH水平无显著差异，黄酮组大鼠TSH水平显著降低（P0。05）。说明黄芪的温热效应可能不是通过促进甲状腺功能产生。
　　5黄芪各给药组对大鼠肾上腺功能的影响
　　如图7所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组、缺多糖组和缺黄酮组大鼠血清中17OHCS水平均显著升高（P0。05、0。01），而黄酮组没有升高，说明黄芪温热效应可能还来自于多糖、皂苷部位对肾上腺功能的促进。
　　6黄芪各给药组对大鼠能量代谢的影响
　　如图8所示，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组、缺皂苷组、缺黄酮组大鼠肝组织中Na，KATP酶活力都有升高的趋势，其中全成分组和缺黄酮组有显著性差异（P0。05）。与对照组相比，全成分组、缺皂苷组、缺黄酮组Ca2，Mg2ATP酶活力都有升高的趋势，其中全成分组和缺皂苷组有显著性差异（P0。05、0。001）。Na，KATP酶、Ca2，Mg2ATP酶活力增加，耗能和产热增加，说明全成分组可以增加机体产热，而多糖与黄酮或皂苷部位配伍之后对产热影响较大。
　　丙酮酸可氧化脱羧生成乙酰辅酶A，然后进入三羧酸循环，最终完全被氧化成CO2、H2O和大量的ATP。与对照组相比，多糖组、皂苷组以及缺皂苷组、缺黄酮组丙酮酸含量有增加的趋势，但无显著性差异。与对照组相比，全成分组、多糖组、缺多糖组和缺黄酮组SDH活力有所升高，其中全成分组和多糖组有显著差异（P0。05、0。01），而黄酮组SDH活力显著降低（P0。05）。说明全成分组、多糖组可促进三羧酸循环加速，促进ATP的生成增加。与对照组相比，皂苷组肝组织LDH活力显著降低（P0。05），其余各组无显著性差异，说明皂苷组可以降低机体无氧代谢的水平。与对照组相比，全成分组、多糖组、黄酮组、缺皂苷组以及缺黄酮组肝糖原含量都有上升的趋势，其中缺皂苷组与缺黄酮组有显著差异（P0。01、0。001），说明含有多糖的配伍组会增加机体的储能。
　　7黄芪各给药组对AMPK介导的PGC1NFR1通路的影响
　　如图9所示，与对照组相比，全成分组、多糖组均可上调大鼠肝组织AMPKmRNA表达水平，其中全成分组有显著性差异（P0。05）；全成分组、多糖组均可显著性增加PGC1、NRF1和TFAMmRNA表达水平（P0。05、0。01）；此外，缺多糖组可显著上调NRF1mRNA表达水平（P0。05），缺皂苷组和缺黄酮组可显著上调TFAMmRNA表达水平（P0。01、0。001）。
　　如图10所示，与对照组相比，各组均可显著上调pAMPK、PGC1和TFAM蛋白表达水平（P0。05、0。01、0。001），各组均上调NRF1蛋白表达水平，其中全成分组、多糖组和缺多糖组有显著性差异（P0。05、0。01）。因此，黄芪全成分组可以促进AMPK功能活化，并作用于下游PGC1、NRF1等因子，从图中可以看出多糖部位对AMPK、PGC1、NRF1和TFAM的mRNA表达水平影响较大，同时对pAMPK、PGC1、NRF1和TFAM的蛋白表达水平的影响也较大。
　　讨论
　　黄芪温热效应引起上火的物质基础及机制分析
　　《黄帝内经》有载：气有余便是火，而黄芪作为补气圣药，长期过量食用可能引发上火反应。体温升高、大便干燥为上火的症候。对大鼠的肛温研究结果表明，黄芪全成分组最为显著，是黄芪温热药性的体现，而体温升高可能是多方面综合作用的体现，如对肾上腺功能的作用，对炎症因子的作用，对能量代谢的作用等，因此虽然各个部位对各个指标的作用有差异，但最终体温的升高来源于几个部位的综合作用，而非单个部位的作用，因此全成分组体温升高最为显著。结合第28天，从各个部位对体温升高的贡献来看，多糖部位贡献最大。
　　全成分组、多糖组粪便含水量降低显著，体现出大便干燥的症状，而缺多糖组粪便含水量有所升高，因此多糖部位对粪便干燥的上火症状影响较大，结合缺皂苷组粪便含水量显著增高，而缺黄酮组粪便含水量降低，表明皂苷对粪便干燥的上火症状也有一定的贡献。《尚书》有言：火曰炎上，上火常出现的症状集中在头面部，如口舌生疮、嗓子干痛、流鼻血等，因此对大鼠的唾液量进行研究，研究结果表明，全成分组、皂苷组、多糖组或含有多糖与皂苷的配伍组大鼠唾液量显著降低，因此多糖部位和皂苷部位对唾液量减少的影响较大，其中多糖部位的影响大于皂苷部位。
　　Huang等〔21〕认为过量食用龙眼导致的上火与炎症相关，因此本研究对炎症因子进行了测定。从实验结果可知，黄芪多糖可显著上调TNF与IL6水平，黄芪皂苷可显著上调TNF水平，黄酮组的IL6和IL1水平显著降低。由此推测，长期超剂量服用黄芪引发的上火可能是由黄芪多糖部位或皂苷部位导致。黄酮部位则体现一定的抗炎活性，也有研究表明黄酮类成分可以通过下调IL6、IL1的水平来改善炎症反应〔2223〕。说明黄芪的上火反应是各部位成分综合的效应，因此在机体本身有一定阴虚阳亢症状时，上火反应会更加明显。
　　研究表明，患有热证大鼠能量代谢紊乱，尤其是与甲状腺功能和钠泵的活性变化相关〔24〕，因此对甲状腺功能进行了测定。在对大鼠甲状腺功能的研究中发现，除缺黄酮组的T4含量有一定的升高外，其余组别均无显著性升高，这说明黄芪导致上火可能不通过甲状腺功能轴实现调节。
　　而相关研究〔2526〕认为上火与交感肾上腺系统相关，17OHCS可以反映交感神经肾上腺系统功能，肾上腺功能的亢进与其分泌呈正相关，因此本研究对血清中的17OHCS进行了测定，结果表明，与对照组相比，全成分组、多糖组、皂苷组等17OHCS含量显著增加，表明以上部位对肾上腺功能有一定的促进作用。能量代谢包括能量的产生与消耗，在这个过程中ATP能直接反映生物体能量代谢水平的高低，是能量的通用货币，ATP酶主要存在于细胞膜与细胞器膜上，其功能是将ATP水解并释放出能量，因此对Na，KATP酶和Ca2，Mg2ATP酶的活力进行了测定。
　　在黄芪及各组分对Na，KATP酶活力的影响中发现全成分组、缺黄酮组增强显著，全成分组、缺皂苷组Ca2，Mg2ATP酶活力增强显著，可以推测全成分组与含有多糖的配伍组可以促进大鼠ATP的分解和产热。SDH是反映线粒体功能的标志酶，其活性的上调代表三羧酸循环的加速与ATP的增加〔27〕，LDH广泛分布在组织中，其活力代表了肝脏的厌氧代谢水平，全成分组、多糖组对SDH具有促进作用，皂苷组对LDH有抑制作用，且多糖部位对于黄芪促进ATP增加作用的贡献最大。肝糖原是由大量葡萄糖分子聚合而成的多糖，以糖原的形式储存在肝脏中，它可以在需要的时候分解成葡萄糖，同时产生能量，多糖组、缺皂苷组和缺黄酮组的肝糖原含量较高，推测因有多糖的存在导致糖原储存较多。
　　有专家认为，上火表现出的皮肤黏膜的红肿热痛、溃疡等症状，与能量代谢密切相关〔2829〕。AMPK能够灵敏地感应细胞内二磷酸腺苷（adenosinediphosphate，ADP）ATP和单磷酸腺苷（adenosinemonophosphate，AMP）ATP的比值变化，被视为能量传感器和能量代谢的总开关。PGC1主要存在于含有线粒体的组织中，它可以在AMPK的调节下辅助激活NFR1与TFAM，促进线粒体的合成〔30〕。
　　赵婷等〔31〕通过建立实热上火动物模型对AMPK能量代谢方面进行研究，表明红参引发的上火与AMPK等上调相关。张喜召等〔4〕通过建立上火模型研究表明对上火动物模型中AMPKPGC1信号通路受到抑制。本研究结果表明，黄芪及各部位对AMPK介导的通路中的关键蛋白AMPK、PGC1、NFR1、TFAM有上调作用，各组分均可促进能量代谢，增强能量储备（图11）。因此黄芪引发的上火反应机制可能与AMPK介导AMPKPGC1通路相关。比较各组的作用大小发现，多糖组作用较强，与全成分组相当或者高于全成分组。
　　综上所述，通过部位扣除结合单个部位给药，对黄芪引起的上火反应从炎症反应、肾上腺功能、ATP酶活力、SDH活力以及AMPK介导的AMPKPGC1通路等方面进行探讨，发现黄芪的3类成分中多糖类成分可能对上火的影响较大，在黄芪相关保健品开发时，可以采用一定的方法控制黄芪多糖的含量，以达到减少上火反应的目的。
　　利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
　　参考文献（略）
　　来源：曹丽珑，裴科，刘瑞，宁燕，赵婷婷，于子涵，吴陈成，邵翔宇，张朔生，王颖莉，胡美变，蔡皓基于部位扣除的黄芪温热效应导致上火反应的物质基础及机制研究〔J〕。中草药，2022，53（14）：43504364。