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全转录组测序+RNA测序发现 lncRNA 调控仔猪细菌性腹泻的分子机制

前言

大肠杆菌 F18 诱发的腹泻是仔猪最常见的肠道炎症疾病之一,可导致严重的经济损失。然而,大肠杆菌 F18 感染易感性的分子机制尚不清楚。

近日,江苏省现代农业(生猪)技术体系良种繁育岗位专家、扬州大学动物科学与技术学院包文斌教授为通讯作者,在国际病原学权威期刊 PLoS Pathogens (IF: 6.823) 发表了题为“Insight into mechanisms of pig lncRNA FUT3-AS1 regulating F18-bacterial diarrhea”的研究论文,首次系统解析了 lncRNA 调控仔猪细菌性腹泻抗性的分子机制。

研究结果

1、猪 FUT3-AS1 是与易感性相关的宿主调节因子

为了研究宿主 lncRNA 在断奶仔猪 F18 感染中的作用,对中国地方猪品种梅山猪和培育品种苏太猪 F18 抗性仔猪和敏感仔猪十二指肠组织,分别进行了全转录组测序。结果显示,共有 3 个 lncRNA 同时在 2 个猪种的 F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达(图 A)。其中 FUT3-AS1 (TCONS_00183659) 是位于 FUT3 基因反义链的一个 lncRNA(图 B)。已有研究表明 FUT3 基因与F18 受体的产生有关,且全转录组测序结果显示 FUT3 在 F18 抗性和敏感仔猪中也存在差异表达。

RT-PCR、Northern blot 证实 FUT3-AS1 在  F18 抗性和敏感仔猪中存在差异表达(图 C-D)。

图1|猪 FUT3-AS1 是与  易感性相关的宿主调节因子

2、下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对  的抗性

进一步研究显示, F18 刺激可以引起猪小肠上皮细胞 IPEC-J2 中 FUT3-AS1 的表达显著上调(图 A)。在 IPEC-J2 细胞中敲降 FUT3-AS1,粘附在细胞上的细菌数量显著降低(图 D-H)。这些结果表明 FUT3-AS1 在调节 18 感染中发挥作用,并且其表达的下调增强了 IPEC-J2 细胞对  18 的抗性。

图2|下调 FUT3-AS1 可以增强 IPEC-J2 细胞对  的耐药性

3、细胞核中 FUT3-AS1 的作用机制

RNA-FISH 和核质分离实验显示 FUT3-AS1 在细胞核和细胞质中均有分布(图 1 E-F),接下来分别研究它在细胞核和细胞质中的作用机制。

qRT-PCR 和 western blot 显示,FUT3-AS1 敲除后细胞中 FUT3 表达显著降低(图 A)。RNA pull-down 鉴定到 19 个与 FUT3-AS1 结合的蛋白质,其中包含组蛋白 H4。RIP-qPCR 显示组蛋白 H4 可以特异性结合 FUT3-AS1(图 E-F)。ChIP、DNA pull-down 结果显示,组蛋白 H4 可以直接结合到 FUT3 核心启动子区域(图 G-H)。

图3|FUT3-AS1 通过影响 FUT3 启动子组蛋白 H4K15ac 水平调控 FUT3 转录

使用组蛋白去乙酰化抑制剂处理 IPEC-J2 细胞,可以显著促进 FUT3 的表达,但并不影响 FUT3-AS1 的表达(图 I-J)。ChIP-qPCR 显示,siFUT3-AS1 细胞中 FUT3 核心启动子区域中 H4K15ac 乙酰化水平显著降低(图 L)。

Alibaba 和 JASPAR 软件预测显示有多个转录因子可以结合到 FUT3 启动子区域。双荧光素酶报告实验表明,转录因子 Sp1 的转录结合活性在 siFUT3-AS1 细胞中表现出显著下降、在组蛋白去乙酰化抑制剂 TSA 处理的细胞中显著增强(图 M)。

以上结果表明,FUT3-AS1 可能通过介导 FUT3 核心启动子上的 H4K16ac 水平和 Sp1 结合活性来促进 FUT3 的表达。

4、细胞质中 FUT3-AS1 的作用机制

Small RNA 测序显示在 抗性和敏感仔猪中有 32 个 miRNA 存在差异表达(图 A),并构建了 ceRNA 调控网络(图 B),其中 miR-212 在 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 中都有结合位点。

IPEC-J2 细胞中上调 miR-212 可以显著降低 FUT3 的表达,而下调 miR-212 可以显著促进 FUT3 的表达(图 C-D)。siFUT3-AS1 细胞中 miR-212 表达显著上调(图 E)。荧光素酶报告和 Ago2 抗体的 RIP 实验证实 miR-212 可以直接与 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 结合(图 G-J)。miR-212 inhibitor 可以显著增加细胞上粘附的细菌数量(图 K-L),但同时敲降 FUT3-AS1 时细菌粘附降低。

以上结果,FUT3-AS1 可作为 miR-212 的分子海绵,促进 FUT3 的表达以增强F18 的敏感性。

图4|FUT3-AS1 作为分子海绵吸附 miR-212 并靶向调节 FUT3

5、FUT3 是防治细菌性腹泻的潜在靶点

FUT3 主要在空肠和十二指肠中表达,并且主要表达于敏感仔猪的小肠上皮黏膜细胞中(图 A-C)。 F18 刺激可以引起 IPEC-J2 细胞中 FUT3 表达(图 E)。FUT3 过表达的 IPEC-J2 细胞粘附的细菌数量明显增加,FUT3 敲除细胞中粘附的细菌数量显著减少(图 I-L)。以上结果表明 FUT3 在 IPEC-J2 细胞对 F18 侵袭易感性中起着关键作用。

图5|FUT3 是防治  细菌性腹泻的潜在靶点

接下来进一步评估 FUT3 在体内的作用。Fut3  敲除小鼠对 F18 诱导的致死性不敏感,而 Fut3 野生型小鼠的肠道出现明显的病变。Fut3 野生型小鼠体内 IL-6 等细胞因子表达水平显著升高、F18 细菌粘附显著升高。以上结果表明,面对  F18 侵袭,Fut3 野生型小鼠的肠道更容易发生病变,推测 FUT3 是断奶仔猪中抵抗 F18 侵染的潜在靶点。

图6|FUT3 是防治细菌性腹泻的潜在靶点

6、FUT3-AS1 激活 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成和 TLR 信号途径

iTRAQ 蛋白组结果显示,FUT3-AS1 敲降的细胞中 388 个蛋白表达发生改变(图 A),其中多个差异表达蛋白参与了鞘糖脂生物合成途径(图 B),并通过 Western blot 和 qPCR 实验得以证实。敲除或过表达 FUT3、以及刺激同样会引起鞘糖脂生物合成途径蛋白的表达变化(图 E-H)。综上所述,这些结果表明 FUT3-AS1 正向调控 FUT3 表达,激活糖鞘脂生物合成信号。

图7|FUT3-AS1 调控 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成途径

Co-IP 鉴定到 14 个与 FUT3 结合的蛋白质,其中包括 LRRFIP2,并通过 CoIP-western blot 证实(下图 A-C)。并且 LRRFIP2 的表达受到 FUT3 敲除或者过表达的影响(图 D)。

LRRFIP2 是已经报道的 TLR 信号途径的正调控因子。qPCR 显示(图 E-F),FUT3 敲除可以显著抑制 TLR4 信号途径成员表达,反之过表达 FUT3 可以显著激活 TLR4 信号途径。FUT3-AS1 敲降也可以显著抑制 LRRFIP2 的表达。这些结果表明,FUT3-AS1 可能通过促进 FUT3 表达来激活 LRRFIP2/TLR 信号途径。

图 8 | FUT3 与 LRRFIP2 互作以调控 TLR 信号途径

研究结论

本研究以仔猪为动物模型,通过全转录组测序鉴定了一种称为 FUT3-AS1 的反义 lncRNA,并阐明了 lncRNA FUT3-AS1 在 IPEC-J2 细胞中调节 F18 易感性性的相关机制:

在细胞核中,FUT3-AS1 通过增加 H4K16ac 修饰水平促进转录因子 Sp1与 FUT3 核心启动子的结合活性,进而上调 FUT3 表达;在细胞质中,FUT3-AS1 通过竞争性结合 miR-212,调节 FUT3 表达。同时,lncRNA FUT3-AS1 通过激活 FUT3 介导的鞘糖脂生物合成和 TLR 信号途径,来增强 F18 的敏感性。

本研究将为开发新的策略来防治仔猪细菌性腹泻提供理论指导。

扬州大学动物科学与技术学院青年教师吴正常、博士研究生范海瑞为论文共同第一作者。欧易生物在本研究中承担全转录组测序、small RNA 测序及分析工作。

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原创声明:本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道,本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享,未经作者的允许禁止转载。

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