多聚酶链式反应扩增DNA片段

　　教学目标：
　　（一）知识与技能
　　1、了解pcr技术的基本操作
　　2、理解pcr的原理
　　3、讨论pcr的应用
　　（二）过程与方法
　　在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源dna污染，严格控制温度等反应条件
　　（三）情感、态度与价值观
　　通过对pcr实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
　　教学重点：pcr的原理和pcr的基本操作
　　教学难点：pcr的原理
　　教学过程：
　　（一）引入新课
　　在现代生物技术中，dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列，就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢？今天我们来研究学习dna分子的扩增技术pcr技术。
　　（二）进行新课
　　1基础知识
　　pcr技术扩增dna的过程，与细胞内dna复制过程类似：
　　11细胞内dna复制条件分析：
　　条件组分作用
　　模板dna的两条单链提供复制的模板
　　原料四种脱氧核苷酸合成dna子链的原料
　　酶解旋酶
　　dna聚合酶打开dna双螺旋
　　催化合成dna子链
　　能量atp为解螺旋和合成子链供能
　　引物rna为dna聚合酶提供合成的3’端起点
　　12细胞内dna复制过程
　　（1）dna的反向平行结构：（结合投影图）
　　核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
　　由核苷酸通过3，5磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
　　dna双螺旋结构的反向平行结构：
　　（2）dna的复制过程：
　　解旋：解旋酶、atp，dna两条链打开，，形成两条dna单链。
　　引物结合：在dna单链3’端与dna反向配对结合，确保引物3’端与dna单链准确配对。
　　dna聚合酶结合：
　　子链合成：dna聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
　　后续加工：dna聚合酶i将引物切去，并合成空缺处的dna单链，再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
　　子链合成特点：不能从头合成；合成方向为5’3’合成。
　　感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能，因此rna的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去，代之以高保真的dna链。
　　思考dna分子能准确复制的原因有哪些？
　　dna双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；dna聚合酶的复查功能。
　　思考细胞内哪些物质是从头合成的？rna合成、蛋白质合成。
　　13dna分子复制的人工控制
　　解开螺旋：在80100时，dna双螺旋打开，形成两条dna单链，称为变性。
　　恢复螺旋：在50左右时，两条dna单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
　　复制条件：缓冲液，dna模板，四种脱氧核苷酸，热稳定dna聚合酶，两种引物。
　　反应场所：pcr仪（自动温度周期性调节）。
　　思考缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）14pcr的反应过程
　　变性：在95时dna解旋
　　复性：在50时引物与dna单链结合
　　延伸：在72时合成dna子链（两个引物间的序列）2实验操作
　　21pcr反应体系：缓冲液、dna模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物，水
　　22实验操作步骤
　　23按照pcr反应体系配方配制反应液；
　　（2）将pcr反应体系50l用微量移液器转移到微量离心管（0。5ml）中；
　　（3）将微量离心管放到pcr仪中；
　　（4）设置pcr仪的工作参数。
　　（5）dna在pcr仪中大量扩增。
　　24水浴法：将微型离心管依次在95、55、72的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
　　3实验注意事项
　　31避免外源dna污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
　　32缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。
　　33每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
　　34混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
　　4结果分析与评价
　　41反应液稀释：取2lpcr反应液，添加98l蒸馏水；2分光光度计调零：将100l蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
　　42将100l反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
　　43计算：dna含量50光吸收值稀释倍数
　　（三）课堂总结、点评
　　（四）实例探究
　　例1在（）的温度范围内，dna的双螺旋结构解开
　　a。1020b。80100c。2030d。4060
　　解析：蛋白质大多不能忍受6080的高温，而dna在80以上才会变性。
　　答案：b
　　例2关于dna的复制，下列叙述正确的是（）
　　a。dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从5’端延伸dna链
　　b。dna复制不需要引物
　　c。引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合
　　d。dna的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
　　解析：由于dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于dna分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在dna聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
　　答案：c
　　综合应用
　　例3下列有关pcr描述，不正确的是（）
　　a。是一种酶促反应
　　b。引物决定了扩增的特异性
　　c。扩增产量按y（1x）n
　　d。扩增对象是氨基酸序列
　　e。扩增对象是dna序列
　　解析：pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术，它以极少量的dna为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使dna聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的dna拷贝，其扩增产量为y（1x）n，y代表dna片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选d。
　　答案：d
　　课后探究
　　1、pcr与生物体dna复制有何区别？
　　2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
　　教后小记
　　教师在教学过程中，可以先引导学生回忆必修2的有关dna复制的知识，在此基础上，学生可加深对于pcr原理的认识。对于pcr反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与pcr的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。