当前，CAR-T 细胞的制备面临需要使用病毒载体和随机插入问题，这些问题一定程度上会制约细胞的大量制备和影响治疗效果的安全性。
近日，华东师范大学生命科学学院，浙大医学院第一附属医院以及 （以下简称“邦耀生物”）的研究人员披露了一种新型非病毒载体定点整合 CAR-T 技术，并展示了首个 PD1 下调定点整合型 CAR-T 细胞的临床试验（指的是研究者发起的临床试验，IIT）数据。相关研究已于近日发表在 Nature 杂志上，据悉，这也是国内首次发表于 Nature 正刊的 CAR-T 研究成果。
这一技术无需病毒载体，使用 CRISPR/Cas9 系统即可直接将表达 CAR 的基因定点插入 T 细胞基因组特定位置。在复发/难治性侵袭性 B 细胞非霍奇金淋巴瘤（r/r B-NHL）的过继治疗中， 8 名患者的完全缓解率为 87.5%，且没有出现严重不良事件。
（来源： Nature ）
研究人员指出，试验结果证明这种新技术生产的 CAR-T 细胞在临床上具有良好的安全性和有效性，为 CAR-T 细胞治疗提供了一种创新性的平台技术，也为解决 CAR-T 领域的痛点提供了新思路。
本研究的通讯作者是华东师范大学生命科学学院的 博士、 博士、 博士、 博士，以及浙江大学医学院附属第一医院的 教授。值得一提的是，张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力也是 的核心管理团队成员。
“在我看来，这项研究最大的突破点在不使用病毒的情况下，通过基因编辑工具 CRISPR/Cas9 将 CAR 定点整合到 PD1 位点，生成治疗用的 CAR-T 细胞，相当于 PD1 抗体和 CAR-T 联合治疗，显著提高了治疗疾病的安全性和有效性。” 告诉生辉。
论文审稿人、UCLA 的 教授指出，这项研究证明了非病毒定点整合 T 细胞治疗在临床应用的可行性。这一技术创新为未来更多基因靶向修饰 CAR-T 疗法的发展奠定了坚实的基础，对领域内发展具有重要的推动作用。
开发非病毒定点整合 CAR-T 技术，已验证技术可行性
是本研究的第一作者、共同通讯作者，他的主要研究方向是基因编辑与肿瘤免疫细胞治疗。他提出了非病毒定点整合 CAR-T 技术，基于这一技术开发了 Quikin CAR-T ® 平台。
官方资料显示，Quikin CAR-T ® 是 搭建的具有自主知识产权的非病毒定点整合 CAR-T 平台，该平台可在不使用病毒载体的情况下，一步实现 CAR 元件在基因组的定点整合和T细胞内源基因的调控干预。
在本次最新的研究报告中，研究人员详细介绍了新型非病毒定点整合 CAR-T 技术以及细胞疗法的临床研究数据。
他们 首先 探索了如何在T细胞中提高大片段 CAR 序列在基因组特定位点的整合效率，多番对比后发现同源臂长度为 800bp 的线性双链 DNA 作为模板时，通过同源介导修复（HDR）机制可以生产数量最多的 CAR-T 细胞。
在确认最佳方案后，选择将 CAR 表达盒（CAR-expressing cassette）靶向 AAVS1 安全港基因座评估这种新技术是否会影响 CAR-T 细胞的特性，并将制备的细胞与慢病毒转染进行了对比。结果表明，与慢病毒转染相比，电穿孔方式增加了 CD8 (+)与 CD4 (+) T 细胞的比例，AAVS1-19bbz（非病毒整合）和 LV-19bbz（慢病毒转染） CD19 CAR-T 细胞均在体外和体内高效清除肿瘤细胞。
▲图|非病毒、整合 AAVS1 的 CAR-T 细胞有效消除肿瘤细胞，图 a 为通过 CRISPR/Cas9 同源重组将 CAR cassette 特异性整合到靶基因座中。（来源： Nature ）
这些试验结果，证明了以非病毒、基因特异性靶向方式生产 CAR-T 细胞策略的可行性。
在证明了非病毒整合技术的可行性后，该研究团队利用这种技术开发出了一种增强型 CAR-T 细胞——PD1 敲除 CD19 CAR-T（PD1-19bbz CAR-T），然后与慢病毒转染生产的 CAR-T 细胞进行了比较。 数据显示非病毒、PD1 整合的 CAR-T 细胞表现出了更高效杀伤肿瘤细胞的潜力。
（来源：邦耀生物官网）
完全缓解率超 87%，首例受试者无癌生存期已超 2 年
基于临床前的数据，研究人员随 后推进了 IIT 临床试验，评估 PD1-19bbz 细 胞治疗 r/r B-NHL 患者的安全性和有效性。这是一项开放标签、单臂的临床研究，于 2020 年 5 月在浙大医学院附属第一医院开展，共入组 8 名未接受过 CAR-T 细胞疗法的 r/r B-NHL 患者。
最新的数据显示，在 12 个月的中位观察期内， 8 名受试者的完全缓解率（CR）为 87.5% ，在最后一次随访时，有 5 名患者表现出持久反应，6 个月时有 2 名患者出现疾病复发，所有患者的最佳客观缓解率为 100%。迄今，首例接受该 CAR-T 疗法的患者无癌生存期最长已超过 2 年， 目前仍处于疾病完全缓解状态中。
此外，在一些患者中观察到轻度细胞因子释放综合征（CRS），不过未发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），以及大于 3 级的不良反应。
论文中还指出，即使在低输注剂量和低 CAR (+)细胞含量时，PD1-19bbz 细胞治疗也表现出了有效性。 在针对 PD-L1 高表达肿瘤患者的治疗，以及 CAR-T 细胞回输剂量和阳性率较低的条件下，PD1-19bbz CAR-T 均显示出了良好的疗效，证明了其肿瘤杀伤能力。
▲图|PD1-19bbz CAR-T 细胞可有效消除 r/r B-NHL 患者的肿瘤细胞，且未出现严重毒性（来源： Nature ）
为进一步解析 PD1-19bbz CAR-T 细胞的特性，他们还对不同方式制备的CAR-T 细胞进行了单细胞 RNA 测序。这些测序数据表明， PD1-19bbz 细胞的记忆性 T 细胞数量增加，抗肿瘤免疫活性增强，这些为该疗法表现出的高效肿瘤杀伤能力提供了机制解释。
“这项研究工作开展了全面系统的临床前研究，成功开发了非病毒定点整合 CAR-T 疗法，并取得了令人鼓舞的早期临床试验结果。” Nature 杂志资深编辑 Victoria Aranda 这样评论道。
“为今后 CAR-T 细胞改造提供技术支持”
上文提到，论文的多名通讯作者也是邦耀生物的核心管理团队。 是一家将基因编辑和细胞治疗技术相结合的 Biotech，除了非病毒定点整合 CAR-T 平台以外，当前还搭建完成了基因编辑技术创新平台、造血干细胞平台、通用型细胞平台、增强型T细胞平台。
过去 5 年间，已产生 100 多项 专利成果，有 5 个项目正在进行 IIT 试验，多个项目处于 IND 申报阶段。 其中，进展最快的是基因编辑用于治疗 β-地中海贫血症管线，已进入正式临床研究阶段。在两个中心开展的 IIT 临床研究已成功治愈 6 例重度地贫病人，最长康复的 2 例病人已经超过二年多。
（来源： 邦耀生物官网）
本研究描述的非病毒、基因特异性靶向 CAR-T 细胞新策略，属于 的一个细胞治疗平台技术—— Quikin CART ® 平台。
论文中指出，这一技术具有成本低、制备时间短、工艺简单、安全性和有效性高等优点， 有望突破细胞疗法的障碍，在细胞治疗中有很大的潜力。
具体解释道，与病毒制备 CAR-T 的方式相比，这种方式制备时间更短，制备工艺也更简单，一步电转即可完成重编程；无需病毒，成本大幅降低，同时也减少了用病毒可能的潜在风险；临床上 CAR 表达均一，毒副作用小，没有 3 级以上细胞因子风暴和神经毒性；更重要的是，临床疗效更好，更多记忆性 T 细胞，相当于 CAR-T 和 PD1 抗体的联合治疗，ORR 为 100%, CR 为 86.7%，而现有病毒 CAR-T 的 CR 通常为 50% 左右等。
更重要的一点是，研究团队已经证明了这项新技术在转化过程中的可行性，也在 IIT 中证明了这项技术安全性和有效性。
在此基础上， 利用 Quikin CART ® 平台开发了靶向 CD19 非病毒 PD1 定点整合 CAR-T 产品 PD1-19bbz（BRL-201）。
研究人员还指出，在临床注射后，与 PD-1 功能相似的抑制性受体在 PD1-19bbz CAR-T 细胞高表达，比如说 LAG-3, TIM-3 和 TIGIT，也就是说可以用于多个免疫检查点敲除的增强型 CAR-T 细胞制备，快速生产通用型 CAR-T 细胞并开发动态调控的安全型 CAR-T 疗法等。
这一发现提示干预多种途径有望进一步增强 CAR-T 细胞的功能，为此后 CAR-T 细胞改造提供了技术支持。
参考资料：
1.https://www.brlmed.com/newsinfo/123.html
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